技術文章8 上游工藝細胞培養放大需求和挑戰

　幾種常見的懸浮培養和放大工藝方式，分別是批次式培養、流加（補料）式培養基灌注式培養。批次式培養是指在生物反應器中一次性加入細胞培養基和接入細胞種子，在培養過程中除了調節培養環境的PH值和溶氧外，不補充培養基也不排出培養基，直至培養過程結束。批次式培養的生長代謝環境相對是一個固定環境，不添加任何營養成分，能夠觀察細胞.
 
細胞生長整個代謝過程。但由于初始營養物質比較豐富，可能會造成細胞早期過量利用，進而積累大量的代謝廢物，培養后期細胞生長易受到抑制，生長周期較短，細胞密度也不高。流加（補料）式培養是指，細胞培養基不是一次性加入反應器中，而是根據細胞生長代謝的情況逐步補加營養成分，維持葡萄糖、谷氨酰胺等關鍵營養物質，來維持合適的平衡濃度，避免培養過程中出現營養限制和有毒代謝產物過量積累，以達到延長細胞培養時間，增加細胞密度和提高產物濃度的目的。灌注式培養是指將細胞和細胞培養基一起加入反應器中后，在細胞生長和產物形成過程中，不斷的流加新鮮培養基，同時通過細胞截留裝置排除培養上清，而活細胞被截留在反應器中的一種操作方式。培養基的不斷流出，可帶走代謝副產物如乳酸、氨等，使其在培養液中維持低濃度水平，避免成為細胞生長的抑制因素，使細胞生長在良好的培養環境中，最終能獲得較高的細胞培養密度和產物生產速率。因此，灌注式培養具有反應體積小，回收體積大，產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫條件下保存，有利于保持產品的活性等特點，一般在小規模生物反應器的條件下應用比較多。不足之處是其操作流程比較復雜，細胞培養基利用率低，工藝放大過程較為困難，細胞截留裝置存在截留效率和堵塞等問題。


攪拌速率和通氣策略作為相對關鍵的體積依賴性的參數，在放大培養過程中會變為公認的難題。由于各型反應器的攪拌方式、罐體設計和性能設計均有不同，因此，很難建立統一或者通用性的放大模型。所以，需要從幾個方面進行全方面的考量。攪拌策略和通氣策略要相互配合，一方面通過適當的攪拌可以促進培養基中的營養物質充分混合，加強氣液傳質的效果，達到理想的培養環境；另一方面，在有效的的供給氧氣傳質的同時，也可以一定程度上幫助排除溶解于培養液中的二氧化碳，保證二氧化碳分壓的正常。不過，過高的攪拌轉速和過大的氣體通氣量，往往會帶來一定的剪切力，在一定程度上可能會對細胞的培養帶來負面的影響。針對細胞培養放大過程中幾個常見因素，進行簡單介紹。


1、氧氣的傳質
氧氣是細胞生存必不可少的條件之一，細胞主要利用的是溶解在細胞培養液中的氧。氣體中的分子態氧溶解在水中稱為溶解氧，簡稱溶氧，是表征水溶液中氧濃度的參數。溶氧也能在一定程度上反映細胞的生理代謝變化和對產物合成的影響，細胞在不同的生長階段對于氧的需求也有所不同。氧氣的供給和傳質是細胞培養過程中一個重要環節，穩定的溶氧水平，是維持細胞正常的重要因素。通常情況下，哺乳類動物細胞，都需要30%-40%的溶氧水平。利用攪拌式的生物反應器，對于較大規?；蜉^高密度的細胞培養來說，細胞對于氧氣的消耗速率較快，氧氣需求量很大，通常會采用通過微泡分布器通氣方式來維持較強的氧氣傳質。微泡分布器，作為微米級的氣體分布器，是通過增加氣泡的表面積來提高氧氣傳質系數。另外，大泡分布器，作為毫米級氣體分布器，能夠帶來較大的通氣量 ，同時可以輔助氣體的排除，因此常用來通入空氣以排除二氧化碳。通過有效的PH值以及溶氧值監測調控，配合泵系統的整體控制，可以給細胞提供優良的生長環境。與此同時，隨著培養體積的增大，反應器體積的增加以及混合時間的明顯增加，有可能帶來反應器內部溶氧水平呈階梯化分布。一般來說，溶氧水平的改變可能會影響細胞的代謝水平，如果較為顯著的改變還可能影響蛋白的糖基化水平，對于產品質量有所影響。因此，對于反應器攪拌效率的考量也是一個較為關鍵的因素。


2、PH和CO₂的控制
PH作為一個重要的工藝參數及控制參數，往往也會直接影響細胞表達產物的質量。PH的控制和調節在整個細胞培養的過程中是一個動態的過程。起始階段，接種前，接入新鮮培養基時，通常需要讓培養基平衡一下，如果PH數偏堿性的話，可以適量通入二氧化碳來平衡PH，為接種細胞做準備。培養過程中代謝的乳酸和通氣中的二氧化碳，會使培養液中的PH一定程度的下降，因而需要補充堿液（例如NaHCO₃ 、NaCO_3等）來實現一個有效的調節。對于堿液濃度的選擇及補堿液的位置也很重要，如果造成局部PH過高，有可能會導致細胞裂解，影響培養結果，因此，通常情況下，會選擇低濃度的堿液來進行控制。由于是外加的溶液，也要考慮滲透壓的影響，應盡可能的降低堿液對滲透壓的增加，同時需平衡對二氧化碳分壓的控制。二氧化碳的控制，在放大培養過程中，二氧化碳的排除一直是較為麻煩的環節。二氧化碳相對于氧氣而言，在液體中的溶解度比較高。細胞每消耗一份子氧氣，便會產生一份子二氧化碳，經過一段時間的積累，二氧化碳的濃度會上升。當反應器中單位二氧化碳濃度達到15%-20%時，會對細胞產生毒害作用，因此一般會加入一定量的NaHCO₃作為緩沖體系。但當二氧化碳濃度遠超過緩沖體系的緩沖能力時，就需要考慮利用通氣量、氣泡尺寸等多種因素共同控制，從而有效地排除二氧化碳。實踐證明，增大深層通氣量或使用大泡分布器可以顯著降低二氧化碳分壓，而改變攪拌轉速或者增加表層通氣量對二氧化碳分壓影響較小。


3、混合效果
與混合效果較為相關的兩個部分分別為，通過攪拌混合達到氣體與液體的充分接觸，并形成穩定的氣體傳質；通過攪拌混合使得液體中的有效成分濃度在整個體系中呈均勻分布，從而達到一個穩定的液體培養環境。為了實現良好的混合效果，對于反應器的整體設計有一定的要求。對于較大體積生物反應器來說，其目的都是為了能夠實現整體培養環境中的穩定和均一。另外一個決定混合效果的因素書攪拌方式。上攪拌、下攪拌、有無軸封、斜攪拌、直攪拌等，不管選擇哪種方式，最終的目的是在盡可能少的對細胞造成損傷的前提下，最大程度提供有效的攪拌效果。采用不同形狀的攪拌槳會帶來攪拌的差異性，不同形式的攪拌均有對于攪拌效果的測試，依據實際需求可以做出選擇。


4、剪切力
  一般在細胞培養過程中提到的剪切力按照來源大致可以分為兩類：攪拌相關和通氣相關。攪拌相關的剪切力主要指由于攪拌槳運動所產生的流體剪切力，可能會對細胞產生一些物理性的損傷，嚴重的可能會導致細胞死亡。也有實例中發現，流體剪切力可能會對抗體的糖基化水平有一定的影響。不過通常來說，細胞反應器內的平均能耗還是相對比較低的，排除一些物理性的因素之外（如攪拌軸自身材質或設計），流體剪切力對于細胞的影響還是比較小的。
關于通氣相關剪切力，根據氣泡的形成周期來分析，可能對細胞的造成影響可簡單分成四個階段：氣體分布器處氣泡的形成；攪拌槳處氣泡的合并與碰撞破裂；反應器內氣泡上升；氣液交換處或接觸面氣泡的碰撞破裂。根據實際經驗，氣液交界面氣泡破裂是導致細胞損傷的剪切力的主要來源，其他方向相對來說影響較小。采用不同孔徑的氣體分布器以及改變分布器與攪拌槳的相對位置也會帶來不同影響，具體問題需要具體分析。
 
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